Sesión 12 Práctica 14: Recuento enterococos fecales por filtración

SESIÓN 12 PRÁCTICA 14: RECUENTO ENTEROCOCOS FECALES POR FILTRACIÓN 27/05/2016
https://youtu.be/JUkAmvsDQ5w
https://youtu.be/R8t4xzA7-68

OBJETIVO

Contar las colonias de enterococos fecales en 100 ml, 50 ml de agua de muestra y 50 ml de agua destilada estéril (1:1), en un medio Slanetz-Bartley, utilizando filtración al vacío.

FUNDAMENTO

Es el indicador bacteriológico más eficiente para evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo, debido a que es muy resistente a las condiciones salinas de este medio y además, está relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras. 

La presencia de Enterococcus faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar contaminación de origen fecal, E. faecalis es considerado como un indicador de contaminación fecal de fuentes humanas, mientras que E. faecium y otras especies indican contaminación de otras fuentes.

MATERIALES Y REACTIVOS

-Vaso de precipitado x3 (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

-Embudo

-Probeta 100 ml

-Pipeta Pasteur

-Matraz Kitasato

-Alcohol

-Agua Destilada Estéril

-Placa Petri estéril

-Pinzas

-Mechero Bunsen

-Filtro reticulado

PROCEDIMIENTO

-Cogemos 50 ml de agua destilada estéril y 50 ml de agua de muestra, vertimos y enrasamos en la probeta con la pipeta Pasteur, y llevamos a 100 ml.

-Una vez hecho este paso, procedemos a filtrar al vacío la mezcla.

-Preparamos la bomba de vacío, matraz Kitasato y mechero Bunsen.

-Echamos un poco de alcohol en un vaso de precipitado, agua destilada estéril en una placa Petri estéril y encendemos el mechero.

-Mojamos las pinzas en alcohol y flameamos rápidamente en el mechero Bunsen.

-Tomamos el filtro y lo metemos en agua destilada estéril, retirando el papel de filtro reticulado y colocándolo sobre el matraz. 

-Flameamos las pinzas de nuevo y procedemos a verter la mezcla sobre el embudo del matraz y encendemos la bomba de vacío. 

-Una vez filtrado, volvemos a flamear las pinzas y tomamos el filtro reticulado, colocándolo, con cuidado de no dejar burbujas, sobre el medio Slanetz-Bartley. 

-Ponemos fecha y nombre de práctica en la placa para identificarla, y metemos en el horno a 44ºC.

CÁLCULO

No ha sido necesario realizar cálculos.

RESULTADO

No hay resultados

Sesión 11 Práctica 13: Siembra de agua peptonada y su lectura de turbidez

SESIÓN 11 PRÁCTICA 13: SIEMBRA DE AGUA PEPTONADA Y SU LECTURA DE TURBIDEZ.

OBJETIVOS

-Siembra de agua peptonada

-Recuento de UFC mediante su absorbancia y escala de MacFarland

FUNDAMENTO

 

Agua peptonada

Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos fisicoquímicos.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona de carne	10.0	Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Cloruro de sodio	5.0
pH final: 7.2 ± 0.2

Incubación: Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

Se suele usar contando con un control negativo sin inocular bacterias como referencia.

Color: ámbar claro

MATERIALES

-Asa de siembra

-Mechero bunsen

-Vasos de precipitado

-Agua destilada

-Mechero

-Gradilla

-Tubos con agua peptonada

-Tubo con agua muestra

PROCEDIMIENTO

- Tenemos que tener el mechero bunsen encendido para tener esterilidad en el ambiente.

-Cogemos el tubo que vayamos a sembrar con la mano no dominante. Con la mano dominante cogemos el asa de siembra, esterilizamos la punta hasta llevar a rojo vivo.

-El tubo con agua peptonada lo abrimos, esterilizamos la boquilla y dejamos el tapón agarrado con el dedo meñique de la mano dominante, cogemos con el asa de siembra del agua de muestra y la movemos de arriba a abajo y a los lados, luego la introducimos en el agua peptonada hasta que se suelte el inóculo.

-Se esterilizar la boquilla del tubo de agua peptonada y el asa de siembra, también se vuelve a esterilizar y la dejamos, cerramos y rotulamos los tubos poniendo nombre y fecha.

Esto lo realizamos con todos los tubos de agua peptonada y los ponemos en la gradilla y lo llevamos a la estufa a 37ºC 24 horas.

- Posteriormente el agua presentará turbidez, cogemos un tubo de agua peptonada sin sembrar para contraste y le damos a auto cero y lo metemos al espectrofotómetro a 550nm y en la celda del blanco, luego, introducimos el tubo de agua peptonada sembrado y apuntamos su absorbancia.

-Ya tenemos la absorbancia del tubo de agua peptonada sembrada, ya solo tenemos que sustituirlo por la Y en la recta de calibrado que hemos hecho antes. Despejamos X y nos dará la UFC/ml.

CÁLCULOS

La abosrbancia del tubo de la muestra es de 0,400 por lo que el cáculo que debemos hacer es de:

0,400= 0,0461 + 0,069X

Despejamos la x y nos da à 5,13·10(elevado a 8)

RESULTADOS

El resultado es de 5,13·10(elevado a 8) UFC/ml

Microorganismos	Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Bueno
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Bueno
Control Negativo	Resultado
Medio sin inocular	Sin cambio

Sesión 10 Práctica 12: Cuantificación de Microorganismos por turbidez

SESIÓN 10 PRÁCTICA 12: CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDEZ

OBJETIVO

Identificar en un agua de muestra el número de microorganismos utilizando el método nefelométrico.

FUNDAMENTO

La espectrofotometría de absorción consiste en la medición de la radiación que llega a un detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente.

En química clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y las medidas se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800 nm. Es aplicable tanto para análisis cualitativos como cuantitativos.

Es un aparato que se utiliza en laboratorio de tratamiento de aguas. Mide la densidad óptica, la absorbancia luz transmitida a través de una suspensión. Se debe realizar una curva estándar para relacionar los valores de absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema.

La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda (λ) corta.

Se mide el número de unidades de colonias según las cantidades de mililitros aquí mostradas:

Hay que realizar las combinaciones de las cantidades de mililitros pertinentes de cloruro de bario y ácido sulfúrico en los tubos contemplados en esta tabla.

MATERIAL Y REACTIVOS

-Tubos de ensayo con tapón

-Pipetas de diferentes volúmenes

-Espectrofotómetro con sus cubetas

-Agua destilada estéril

-H₂SO₄ 0,36M

-BACl₂ 0,048M

PROCEDIMIENTO

- Encedemos el espectrofotómetro.

- Pulsamos GO TO WL.

- Ponemos la absorbancia en 550 nm damos a enter.

- Medimos la absorbancia de los diferentes tubos.

- Ponemos la celda en Blanco (B).

-Para el tubo 0 cogemos agua estéril para hacer autocero en el espectrofotómetro.

-Cogemos tubos de menos concentrados a más concentrados recogemos con pipeta pasteur y hechamos al cubeta. La cubeta se coge por la parte rallada.

-Se mete en el espectrofotómetro y apuntamos absorbancia.

-La absorbancia de la muestra del espectrofotómetro es: A= 0,400 Este dato se sustituye en la ecuación en la variable Y obteniendo el número de UFC/ml.

Sesión 9 Práctica 11: Recuento de Coliformes Fecales en Placa

SESIÓN 9 PRÁCTICA 11: RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN PLACA
https://youtu.be/j1ppySotUbs
https://youtu.be/elHzhlypMe0
https://youtu.be/SBPjQg1MdVA

OBJETIVO

Cultivar E.coli en placa y hacer recuento de la misma.

FUNDAMENTO

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias.
La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. 

Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.

Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levaduras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes. 

Este medio de cultivo,es útil para la orientación y no confirmación de especies bacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con brillo metálico), por lo cual será necesario realizar pruebas bioquímicas, para la identificación de género y especie.

	Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Suspender 37,4 g de polvo por litro de agua destilada, dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta disolución total. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121°C. Lactosa 10.0 Fosfato dipotásico 2.0 Agar 15.0 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065 pH final:7.1 ± 0.2

MATERIALES

- Medio Levine

- Asa de siembra de Digralsky

- Placas de petry

- Alcohol

- Mechero bunsen

- Micropipeta de 1ml

- Vasos de precipitado

- Agua destilada

-  4 Tubos de ensayo

- Mechero

- Gradilla

PROCEDIMIENTOS

·         - Se ponen en 4 tubos 9 ml de agua destilada

·        - Después se echa en el primer tubo, del primer tubo una vez mezclado se coge un mililitro y se echa en el segundo, se cambia de punta, se mezcla el tubo 1/100 se coge un milititro y se pasa al tubo 1/1000, se cambia de punta, se mezcla el tubo se coge un mililitro y se pasa al tubo 1/10000.

      - Posteriormente, se le introduce 0,5ml, de cada tubo en una placa diferente.

·       - Se coge el asa de Digralsky y se reparte uniformemente en la superficie del agar, hasta que se agarra y más tarde se le da le vuelta.

CALCULOS

En un octavo he contado 98 colonia tubo 1 -> E. Coli (Grandes, amarillentas)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 0,5ml    -> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 98x8x10/0,5= 15680 UFC/ml de E.coli

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300) porque inhiben las bacterias impidiendo el crecimiento de microorganismos.

RESULTADOS

Microorganismos	Crecimiento	Características de las colonias
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno a excelente	Verdosas con brillo metálico y centro negro azulado
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Bueno a excelente	Mucosas, rosa púrpura, confluentes
P. aeruginosa ATCC 27853	Bueno a excelente	Incoloras
Proteus mirabilis ATCC 43071	Bueno a excelente	Incoloras
S. aureus ATCC 25923	Pobre	Incoloras, pequeñas, puntiformes
Enterococcus faecalis ATCC 29212	Pobre	Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022	Bueno a excelente	Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Bueno a excelente	Incoloras

Sesión 8 Práctica 10: Recuentos coliformes totales por filtración

SESIÓN 8 PRÁCTICA 10: RECUENTO COLIFORMES TOTALES POR FILTRACIÓN

OBJETIVO

Contar las colonias de coliformes totales en 100 ml, 50 ml de agua de muestra y 50 ml de agua destilada estéril (1:1) en un medio ENDO, utilizando filtración al vacío.

FUNDAMENTO

La presencia de bacterias patógenas como Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. están en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en las áreas de mayor densidad de la población. Este tipo de bacterias son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales. La técnica de filtración por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan membranas que tienen un tamaño de poro de 0.45 micras ya que la mayoría de los microorganismos tienen un tamaño superior (diámetro).

La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo público establece como análisis microbiológicos a realizar las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales, gérmenes totales, estreptococos fecales y clostridios sulfito-reductores. El número de determinaciones se establece para cada tipo de análisis, si este es mínimo, normal o completo.

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación.

 

MATERIALES Y REACTIVOS

- Vaso de precipitado x2 (agua muestra, alcohol)

- Embudo

-  Probeta 100 ml

- Pipeta Pasteur

- Matraz Kitasato

- Alcohol

- Placa Petri estéril

- Pinzas

- Mechero Bunsen

- Mechero

- Filtro reticulado

PROCEDIMIENTO

-Cogemos 100 ml de agua de muestra, vertimos y enrasamos en la probeta con la pipeta Pasteur.

-Ahora filtramos al vacío el agua de muestra.

-Preparación para la filtración al vacío con el Kitasato: Preparamos la bomba de vacío, matraz Kitasato y mechero Bunsen.

-Echamos un poco de alcohol en un vaso de precipitado, agua destilada estéril en una placa Petri estéril y encendemos el mechero.

-Mojamos las pinzas en alcohol y flameamos rápidamente en el mechero Bunsen.

-Tomamos el filtro y lo metemos en agua destilada estéril, retirando el papel de filtro reticulado y colocándolo sobre el matraz.

-Flameamos las pinzas de nuevo y procedemos a verter la mezcla sobre el embudo del matraz y encendemos la bomba de vacío.

-Una vez filtrado, volvemos a flamear las pinzas y tomamos el filtro reticulado, colocándolo, con cuidado de no dejar burbujas, sobre el medio ENDO 

-Ponemos fecha y nombre de la práctica en la placa para identificarla, y metemos en el horno a 40ºC.

CÁLCULO

UFC/ml: no importa porque salió menos de 30.

RESULTADO

No hay resultados

Sesión 7 Práctica 9: Recuento aerobios mesófilos por filtración

SESIÓN 7 PRÁCTICA 9: RECUENTO AEROBIOS MESÓFILOS POR FILTRACIÓN

OBJETIVOS

Contar las colonias de aerobios mesófilos en 100 ml, 50 ml de agua de muestra y 50 ml de agua destilada estéril (1:1) en un medio PCA, utilizando filtración al vacío.

FUNDAMENTO

La productividad de este medio, está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Realizando una filtración al vacío mediante un matraz Kitasato para hacer pasar por un filtro de poro 0,45 µm el agua y se retengan los microorganismos.

El PCA(Plate Count Agar) no es un medio selectivo, es un medio muy nutritivo, para que crezca todo. Se utilizara para hacer un recuento de bacterias en el agua, como Estreptococos.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Extracto de levadura	2.5	Suspender 23,5 g en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición con agitación constante. Distribuir. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C.
Tripteína	5.0
Glucosa	1.0
Agar	15.0
pH final: 7.0 ± 0.2

Incubación: Durante 24-48 horas a 32-35 °C en aerobios.

 

MATERIALES Y REACTIVOS

-  Embudo 

-  Filtro reticulado

-  Probeta 100 ml

-  Pipeta Pasteur

-  Matraz Kitasato

-   Alcohol

-  Placa Petri estéril

-  Pinzas

-  Mechero Bunsen

-  Mechero

- Vasos de precipitado x2 (agua muestra, alcohol)

PROCEDIMIENTO

- Cogemos 50 ml de agua destilada estéril y 50 ml de agua de la muestra, vertimos y enrasamos en la probeta con la pipeta Pasteur.

- Ahora filtramos al vacío el agua de muestra.

- Preparación para la filtración al vacío con el Kitasato: Preparamos la bomba de vacío, matraz Kitasato y mechero Bunsen (mismo procedimiento para las filtraciones). 

- Echamos un poco de alcohol en un vaso de precipitado, agua destilada estéril en una placa Petri estéril y encendemos el mechero. 

- Mojamos las pinzas en alcohol y flameamos rápidamente en el mechero Bunsen. Tomamos el filtro y lo metemos en agua destilada estéril, retirando el papel de filtro reticulado y colocándolo sobre el matraz. 

- Flameamos las pinzas de nuevo y procedemos a verter la mezcla sobre el embudo del matraz y encendemos la bomba de vacío. 

- Una vez filtrado, volvemos a flamear las pinzas y tomamos el filtro reticulado, colocándolo, con cuidado de no dejar burbujas, sobre el medio PCA

- Ponemos nombre y fecha de la práctica en la placa para identificarla, y metemos en el horno a 37ºC.

RESULTADOS

Microorganismos	Crecimiento
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Bueno
Bacillus cereus ATCC 10876	Bueno
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno
Lactobacillus fermentum ATCC 9338	Regular
Streptococcus agalactiae ATCC 13813	Bueno