Sesión 6 Práctica 8: Recuento en placa de Salmonella

SESIÓN 6 PRÁCTICA 8: RECUENTO EN PLACA DE SALMONELLA 19/05/2016

OBJETIVO

Cultivar salmonella en placa y hacer recuento de la misma.

FUNDAMENTO

El verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Pluripeptona	10.0	Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa.
Extracto de levadura	3.0
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Sacarosa	10.0
Rojo fenol	0.08
Verde brillante	0.0125
Agar	20.0
pH final: 6.9 ± 0.2

MATERIALES

- Medio Verde Brillante

- Asa de siembra de Digralsky

- Placas de petry

- Alcohol

- Mechero bunsen

- Micropipeta de 1ml

- Vasos de precipitado

- Agua destilada

-  4 Tubos de ensayo

- Mechero

- Gradilla

PROCEDIMIENTOS

·   - Se ponen en 4 tubos 9 ml de agua destilada, a continuación, se realizan una serie de diluciones seriadas a 1:10, se coge de la muestra un mililitro.


     - Después se echa en el primer tubo, del primer tubo una vez mezclado se coge un mililitro y se echa en el segundo, se cambia de punta, se mezcla el tubo 1/100 se coge un milititro y se pasa al tubo 1/1000, se cambia de punta, se mezcla el tubo se coge un mililitro y se pasa al tubo 1/10000.

    

     - Después, se le introduce 0,5 ml, de cada tubo en una placa diferente, se coge el asa de Digralsky y se reparte uniformemente en la superficie del agar, hasta que se agarre y más adelante se le da le vuelta.

CALCULOS

264 colonias tubo 1 -> salmonella (Blanquecinas y pequeñas)

1 colonia       tubo 1 -> E. Coli (Grandes, amarillentas)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 0,5ml-> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 264 x 10/0,5=5280 UFC/ml de salmonella

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300) porque inhiben las bacterias impidiendo el crecimiento de microorganismos.

RESULTADOS

Microorganismos	Características de las colonias
Escherichia coli ATCC 25922	Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento
Salmonella enteritidis ATCC 13076	Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo
Salmonella typhi	Crecimiento inhibido
Salmonella typhimurium ATCC 14028	Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo
Shigella flexneri. ATCC 12022	Crecimiento inhibido
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Crecimiento inhibido