Sesión 3 Práctica 5: Siembra de cultivos

SESIÓN 3 PRÁCTICA 5:

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO

·         Aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo.

·         Manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.

FUNDAMENTO

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. 

Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:  

·         - Que se efectúen asépticamente.

·    - Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados.  

·         - Que se realicen solo los manipuleos indispensables.  

·     - Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

·   - Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar. 

MATERIALES

·         -Erlenmeyer de 250 ml o botella con tapón de rosca

·        - Espátula

·        - Vidrio de reloj

·        - Agar

·        - Peso para pesar la cantidad de agar necesario

·        - Placas Petri estériles

·        - Microondas

·        - Agua destilada

·         -Espátulas de Drigalsky

·         -Ansa de platino

·         -Tubos de ensayo

·        - Muestra a analizar

·         -Algodón y gasa

·         -Agua de peptona

·        - Mechero Bunsen

·         -Permanente

·        - Autoclave

Preparación medio de cultivo:

Se siguen las instrucciones del rótulo del medio de acuerdo a la cantidad a preparar, haciendo una regla de 3. Se transfiere el medio a un erlenmeyer después de haberlo pesado y ayudándonos de un embudo, una varilla, y el agua destilada establecida. 

Disolvemos los grumos que puedan formarse removiendo la mezcla y la llevamos a ebullición dos o tres veces en el mocroondas .

Se cubre el erlenmeyer con un tapón de algodón envuelto en gasa,con un papel en su interior indicando el tipo de agar utilizado y se cubre con papel albal.

Se esteriliza en el autoclave. Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45ºC. En caso de que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.

PROCEDIMIENTOS

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar.

Medios sólidos:

·        -Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.

·     -Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

·         -Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.

              

Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objetivo es obtener colonias aisladas:

         Técnica A: Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se gira la placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por último, sin quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

     Técnica B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.

·       -Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: Se colocan 5 ml de medio de cultivo fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar.

           El inóculo se siembra, con ayuda de un ansa, de la siguiente manera:

      

     -En profundidad con ansa de punta: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce mediante punción en el medio contenido en la parte inferior del tubo

 

      -En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag.

·      Método de siembra en medio líquido: Se trata de, mediante el ansa, colectar microorganismos de la muestra e introducirlos a continuación en un medio de agua peptonada.

Se prepara un volumen de Agua de peptona, de acuerdo a las instrucciones del rotulo y se distribuye en porciones de 9 ml en tubos de ensayo. De igual forma se preparan erlenmeyer conteniendo 90 ml de agua de peptona.

Información mas detallada sobre cada procedimiento:

      A-(recuento total): Se mide 1 ml con pipeta estéril de la dilución a sembrar, se vierte la misma en una placa de Petri, levantando lo menos posible la tapa. Agregar 10 a 12 ml de medio APC fundido y a una temperatura no mayor de 45º. Tapar rápidamente e imprimir a la placa movimientos circulares suaves en un sentido y otro (aproximadamente 5 veces cada sentido). Dejar solidificar, invertir la placa de manera que la tapa quede en la base, y llevar a estufa de cultivo a 30ºC. El tiempo de incubación es de 72 +/- 2 hs. Transcurrido dicho periodo, efectuar la lectura. Cada una de las células aisladas dará lugar, después de la incubación correspondiente, a una colonia, de forma que el número de éstas nos permitirá estimar el número de células presentes en la muestra original sembrada. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadística, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 

     b- Agar VRBL (Violeta rojo bilis lactosa) (recuento de coliformes): Se trabaja de la manera descrita en 1, hasta solidificar el medio. Una vez sólido, se vierte sobre la superficie una capa de 8 a 10 ml de medio de cultivo, se deja solidificar, se invierte la placa y se incuba en estufa de cultivo a 37ºC durante 48 +/- 2 hs. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del indicador de pH contenido en el medio al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a 2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

      c- Agar Baird – Parker (recuento de estafilococos coagulasa positiva): Primero se vierten en placa de Petri estéril de 10 a 12 ml del medio de cultivo fundido. Una vez que el medio este sólido y firme, se inocula el mismo con 0.1 ml de la dilución a analizar, esparciendo el inóculo con ayuda de una espátula de Drigalsky hasta su absorción total por parte del medio. Se cierra la placa, se invierte y se incuba durante 48 hs a 35ºC. La presencia de Staphylococcus aureus se manifiesta por la presencia de Colonias negras con borde incoloro, convexas, rodeadas de una zona opaca, con una zona clara externa.

      d- Caldo Mc Conkey (coliformes): Este caldo selectivo se basa en la estadística y por lo tanto se utiliza de la siguiente manera: Cada dilución seleccionada se siembra en 9 tubos de caldo Mc Conkey de acuerdo al esquema:

·         3 tubos → 10 ml de dilución en 10 ml de caldo preparado con el doble de la concentración indicada en el rótulo.

·          3 tubos → 1 ml de dilución en 10 ml de caldo preparado con la concentración indicada en el rótulo

·          3 tubos → 0.1 ml de dilución en 10 ml de caldo preparado con la concentración indicada en el rótulo Los tubos se incuban en estufa de cultivo a 37ºC durante 48 +/- 2 hs.