OBJETIVO
Realizar la tinción de
Gram de una muestra de agua concreta.
FUNDAMENTO
Es probable que la diferencia entre las
bacterias grampositivas y gramnegativas se deba a la naturaleza física de sus
paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece
actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta.
Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal
violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante.
En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la
capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; así
las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de
peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y
con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol
extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su
porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo
cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas.
MATERIALES
Cubeta de cristal
Puente de tinción
Mechero bunsen
Vaso de precipitado
Pipeta Pasteur x3
Asa de siembra
Portaobjetos
Agua destilada
Papel secante
REACTIVOS
Lugol
Acetona (30% acetona y 70%
Etanol)
Safranina
Cristal violeta
PROCEDIMIENTOS
1. Primero se pone una cubeta y sobre el un
puente de tinción que es sobre lo que vamos a trabajar, siempre sobre un papel
para evitar posibles manchas en la mesa.
2. Cogemos un portaobjetos y en caso de ser un
medio espeso sobre el que vamos a hacer la tinción añadimos una gota de
solución salina estéril. En caso de ser ya un medio líquido podemos obviar este
paso.
3. Tomamos una colonia de la muestra que vamos a
tintar y disgregamos por el centro del portaobjetos de forma que quede
delimitado en el centro pero bien extendido para evitar grumos o aglomeraciones
de células.
4. Secamos el contenido del porta objetos bien
al aire o sobre la llama del mechero bunsen teniendo cuidado que no vayamos a
quemar de más la muestra, cuando se seque pasamos 4 o 5 veces otra vez la
muestra para fijar bien los microorganismos.
6. Lavar con abundante agua corriente el exceso
de colorante, es importante lavar por lo menos durante 4 o 5 veces siempre
intentado quitar todo el exceso posible de tinte hasta que el porta objetos
tenga la zona con la muestra con un tenue color azulado .En nuestro caso usamos
agua del grifo porque sabemos que tiene un pH correcto, pero en caso de no
serlo usar agua con un pH neutro.
7. Ahora añadiremos Lugol durante un minuto a la
muestra, actuara como una “laca” fijando bien el tinte a las células que lo
tengan.
8. Lavar otra vez con agua en exceso para
eliminar bien, repetir durante tres o cuatro veces.
9. Ahora procedemos a utilizar el
Alcohol-Acetona 7:3, verteremos gota a gota en el portaobjetos inclinado
durante unos 40 segundos. Es recomendado 1 minuto pero evita más errores
quitarlo un poco antes.
10. Lavar con abundante agua en exceso otra vez,
pero en este caso especialmente para asegurarnos que se elimina todo el
disolvente, es importante este paso.
11. Por último añadiremos la Safranina, que es el
segundo colorante que usaremos o colorante de contraste para darle la tinción a
las bacterias Gram negativas. Lo haremos durante un minuto.
12. Lavar con abundante agua
en exceso.
13. Dejaremos secar la preparación para poder ser
utilizada en el microscopio.
14. Examinar la composición de la placa al
microscopio, pudiendo ir con el revolver de más lejano a cercano o rápidamente
con el objetivo 100X y aceite de inmersión.
MEDIDAS PREVENTIVAS
-Nunca utilizar acetona
pura porque eliminaría completamente la tinción
-Usar guantes a la hora de
realizar la tinción ya que los indicadores son muy fuertes y tarda en
eliminarse el color de la piel
RESULTADOS
Presencia de bacilo gram –
y enterococos gram +
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